വാർത്ത

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) എന്നത് β-galactosidase സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിന്റെ ഒരു അനലോഗ് ആണ്, ഇത് വളരെ പ്രേരിപ്പിക്കാവുന്നവയാണ്.IPTG യുടെ ഇൻഡക്ഷനു കീഴിൽ, ഇൻഡ്യൂസറിന് റെപ്രസർ പ്രോട്ടീനുമായി ഒരു സമുച്ചയം ഉണ്ടാക്കാൻ കഴിയും, അതിനാൽ റിപ്രസർ പ്രോട്ടീന്റെ രൂപീകരണം മാറ്റപ്പെടുന്നു, അതിനാൽ ഇത് ടാർഗെറ്റ് ജീനുമായി സംയോജിപ്പിക്കാൻ കഴിയില്ല, കൂടാതെ ടാർഗെറ്റ് ജീൻ കാര്യക്ഷമമായി പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.അപ്പോൾ പരീക്ഷണ സമയത്ത് IPTG യുടെ സാന്ദ്രത എങ്ങനെ നിർണ്ണയിക്കണം?വലുതാണോ നല്ലത്?
ആദ്യം, നമുക്ക് IPTG ഇൻഡക്ഷന്റെ തത്വം മനസ്സിലാക്കാം: E. coli യുടെ ലാക്ടോസ് ഓപ്പറോൺ (ഘടകം) യഥാക്രമം β-galactosidase, permease, acetyltransferase എന്നിവ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന Z,Y, A എന്നീ മൂന്ന് ഘടനാപരമായ ജീനുകൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു.lacZ ലാക്ടോസിനെ ഗ്ലൂക്കോസിലേക്കും ഗാലക്ടോസിലേക്കും അല്ലെങ്കിൽ അലോ-ലാക്ടോസിലേക്കും ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യുന്നു;lacY പരിതസ്ഥിതിയിലെ ലാക്ടോസിനെ കോശ സ്തരത്തിലൂടെ കടന്നുപോകാൻ അനുവദിക്കുകയും കോശത്തിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു;ലാക്‌എ അസറ്റൈൽ ഗ്രൂപ്പിനെ അസറ്റൈൽ-കോഎയിൽ നിന്ന് β-ഗാലക്‌ടോസൈഡിലേക്ക് മാറ്റുന്നു, ഇതിൽ വിഷ പ്രഭാവം നീക്കം ചെയ്യുന്നു.കൂടാതെ, ഒരു ഓപ്പറേഷൻ സീക്വൻസ് O, ഒരു സ്റ്റാർട്ടിംഗ് സീക്വൻസ് P, ഒരു റെഗുലേറ്ററി ജീൻ I എന്നിവയുണ്ട്. I ജീൻ കോഡ് ഒരു റിപ്രസ്സർ പ്രോട്ടീനാണ്, അത് ഓപ്പറേറ്റർ സീക്വൻസിൻറെ സ്ഥാനം O യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, അങ്ങനെ ഒപെറോൺ (മെറ്റാ) അടിച്ചമർത്തപ്പെടുന്നു. ഓഫ് ചെയ്തു.കാറ്റാബോളിക് ജീൻ ആക്റ്റിവേറ്റർ പ്രോട്ടീൻ-സിഎപി ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റിനായി ഒരു ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റും ഉണ്ട്.ജീൻ ഉൽപന്നങ്ങളുടെ കോർഡിനേറ്റഡ് എക്‌സ്‌പ്രഷൻ നേടുന്നതിന് മൂന്ന് എൻസൈമുകളുടെ കോഡിംഗ് ജീനുകൾ ഒരേ നിയന്ത്രണ മേഖലയാണ് നിയന്ത്രിക്കുന്നത്.

ലാക്ടോസിന്റെ അഭാവത്തിൽ, ലാക് ഓപ്പറോൺ (മെറ്റാ) അടിച്ചമർത്തൽ അവസ്ഥയിലാണ്.ഈ സമയത്ത്, PI പ്രൊമോട്ടർ സീക്വൻസിൻറെ നിയന്ത്രണത്തിലുള്ള I സീക്വൻസ് പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ലാക് റിപ്രസ്സർ O സീക്വൻസുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് RNA പോളിമറേസിനെ പി സീക്വൻസുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിൽ നിന്ന് തടയുകയും ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആരംഭിക്കുന്നതിനെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു;ലാക്ടോസ് ഉള്ളപ്പോൾ, ലാക് ഓപ്പറോൺ (മെറ്റാ) പ്രേരിപ്പിക്കാനാകും, ഈ ഓപ്പറോൺ (മെറ്റാ) സിസ്റ്റത്തിൽ, യഥാർത്ഥ ഇൻഡ്യൂസർ ലാക്ടോസ് അല്ല.ലാക്ടോസ് സെല്ലിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുകയും β-ഗാലക്റ്റോസിഡേസ് വഴി ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും അലോലാക്ടോസായി മാറുകയും ചെയ്യുന്നു.രണ്ടാമത്തേത്, ഒരു പ്രേരക തന്മാത്ര എന്ന നിലയിൽ, റിപ്രസർ പ്രോട്ടീനുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും പ്രോട്ടീൻ കോൺഫോർമേഷൻ മാറ്റുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഒ സീക്വൻസിൽ നിന്നും ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനിൽ നിന്നും റെപ്രസർ പ്രോട്ടീന്റെ വിഘടനത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.ഐസോപ്രൈൽത്തിയോഗലാക്ടോസൈഡ് (IPTG) അലോലാക്ടോസിന്റെ അതേ ഫലമാണ്.ഇത് വളരെ ശക്തമായ ഒരു പ്രേരണയാണ്, ഇത് ബാക്ടീരിയകളാൽ മെറ്റബോളിസീകരിക്കപ്പെടാത്തതും വളരെ സ്ഥിരതയുള്ളതുമാണ്, അതിനാൽ ഇത് ലബോറട്ടറികളിൽ വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.

IPTG യുടെ ഒപ്റ്റിമൽ കോൺസൺട്രേഷൻ എങ്ങനെ നിർണ്ണയിക്കും?ഒരു ഉദാഹരണമായി E. coli എടുക്കുക.
പോസിറ്റീവ് റീകോമ്പിനന്റ് pGEX (CGRP/msCT) അടങ്ങിയ E. coli BL21 ജനിതകമാറ്റം വരുത്തിയ സ്‌ട്രെയിൻ 50μg·mL-1 Amp അടങ്ങിയ LB ലിക്വിഡ് മീഡിയത്തിലേക്ക് കുത്തിവയ്‌ക്കുകയും 37°C താപനിലയിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് സംസ്‌കരിക്കുകയും ചെയ്‌തു.വിപുലീകരണ സംസ്കാരത്തിനായി 1:100 എന്ന അനുപാതത്തിൽ 50μg·mL-1 Amp അടങ്ങുന്ന 50mL ഫ്രഷ് LB ലിക്വിഡ് മീഡിയത്തിന്റെ 10 കുപ്പികളിലേക്ക് മുകളിൽ പറഞ്ഞ സംസ്കാരം കുത്തിവയ്ക്കുകയും OD600 മൂല്യം 0.6~0.8 ആയിരുന്നപ്പോൾ, IPTG അന്തിമ സാന്ദ്രതയിലേക്ക് ചേർക്കുകയും ചെയ്തു.ഇത് 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ആണ്.ഒരേ താപനിലയിലും ഒരേ സമയത്തും ഇൻഡക്ഷനു ശേഷം, അതിൽ നിന്ന് 1 മില്ലി ബാക്റ്റീരിയൽ ലായനി എടുക്കുകയും, ബാക്ടീരിയൽ കോശങ്ങൾ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ശേഖരിക്കുകയും പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷനിലെ വിവിധ IPTG സാന്ദ്രതകളുടെ സ്വാധീനം വിശകലനം ചെയ്യാൻ SDS-PAGE ന് വിധേയമാക്കുകയും ചെയ്തു, തുടർന്ന് ഏറ്റവും വലിയ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ഉള്ള IPTG കോൺസൺട്രേഷൻ തിരഞ്ഞെടുക്കുക.
പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് ശേഷം, IPTG യുടെ സാന്ദ്രത കഴിയുന്നത്ര വലുതല്ലെന്ന് കണ്ടെത്തും.കാരണം, IPTG-ക്ക് ബാക്ടീരിയയ്ക്ക് ഒരു പ്രത്യേക വിഷാംശം ഉണ്ട്.ഏകാഗ്രത കവിയുന്നത് കോശത്തെയും നശിപ്പിക്കും;പൊതുവായി പറഞ്ഞാൽ, സെല്ലിൽ കൂടുതൽ ലയിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നത് മികച്ചതാണെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു, എന്നാൽ മിക്ക കേസുകളിലും IPTG യുടെ സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലായിരിക്കുമ്പോൾ, വലിയ അളവിൽ ഉൾപ്പെടുത്തൽ രൂപപ്പെടും.ശരീരം, പക്ഷേ ലയിക്കുന്ന പ്രോട്ടീന്റെ അളവ് കുറഞ്ഞു.അതിനാൽ, ഏറ്റവും അനുയോജ്യമായ IPTG കോൺസൺട്രേഷൻ പലപ്പോഴും വലുതല്ല, മറിച്ച് കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയാണ്.
ജനിതകമാറ്റം വരുത്തിയ സ്‌ട്രൈനുകളുടെ ഇൻഡക്ഷന്റെയും കൃഷിയുടെയും ഉദ്ദേശ്യം ടാർഗെറ്റ് പ്രോട്ടീന്റെ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെലവ് കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുക എന്നതാണ്.ടാർഗെറ്റ് ജീനിന്റെ പ്രകടനത്തെ സ്‌ട്രെയിനിന്റെ സ്വന്തം ഘടകങ്ങളും പ്ലാസ്മിഡും മാത്രമല്ല, ഇൻഡ്യൂസറിന്റെ സാന്ദ്രത, ഇൻഡക്ഷൻ താപനില, ഇൻഡക്ഷൻ സമയം എന്നിവ പോലുള്ള മറ്റ് ബാഹ്യ അവസ്ഥകളും ബാധിക്കുന്നു.അതിനാൽ, പൊതുവേ, ഒരു അജ്ഞാത പ്രോട്ടീൻ പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നതിനുമുമ്പ്, അനുയോജ്യമായ സാഹചര്യങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിനും മികച്ച പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ നേടുന്നതിനും ഇൻഡക്ഷൻ സമയം, താപനില, IPTG സാന്ദ്രത എന്നിവ പഠിക്കുന്നതാണ് നല്ലത്.